روشهای ویروس شناسی تخم مرغ جنین دار، كشت سلول، Elisa، HI، PCR

یكی از شاخصه های مهم درمان تشخیص صحیح و سریع عامل عفونی می باشد هم اكنون علم تشخیص جایگاه رفیعی در علم پزشكی پیدا كرده و سالیانه میلیاردها دلار سرمایه در جهت پیشرفت این علم هزینه می‌شود در بیماریهای عفونی دستیابی به تشخیص صحیح باعث می‌شود كه درمان توسط پزشك به نحو مطلوبی انجام گیرد

روشهای ویروس شناسی تخم مرغ جنین دار، كشت سلول، Elisa، HI، PCR

مقدمه:

یكی از شاخصه های مهم درمان تشخیص صحیح و سریع عامل عفونی می باشد.

هم اكنون علم تشخیص جایگاه رفیعی در علم پزشكی پیدا كرده و سالیانه میلیاردها دلار سرمایه در جهت پیشرفت این علم هزینه می‌شود.

در بیماریهای عفونی دستیابی به تشخیص صحیح باعث می‌شود كه درمان توسط پزشك به نحو مطلوبی انجام گیرد.

كه نتیجه آن ارتقاء سطح بهداشت عمومی و از سوی دیگر اعتماد و اطمینان بیمار و پزشك به آزمایشگاه است.

انواعی از بیماریهای عفونی در انسان بوسیله ویروس ها ایجاد می شوند، برخی از این بیماریها فوق العاده كشنده بود، مثل هاری، هپاتیت، ایدز، تبهای هموراژیك و انسفالیت و برخی هم ناراحتیهای مختلفی در انسان ایجاد می‌كنند مثل سرماخوردگی، اوریون، عفونت با هر ویروس ها برخی مثل سرخچه و سیتومگالو ویروس ها ناهنجاریهای مادرزادی ایجاد می‌كنند بالاخره بعضی از ویروس ها تومور و سرطان ایجاد می‌كنند.

شیوع روز افزون بیماری های ویروس اهمیت و استفاده از روشهای پیشرفته در تشخیص این عوامل را بیش از پیش مطرح می سازد.

در سیر تكامل شعب مختلف علوم پزشكی رشته ویروس شناسی نیز مستثنی نبوده و پیوسته محققین آن در حال تكاپیو و تحقیق هستند كه حاصل تجربیات آنها راهنمای ما در یافتن روشهای بهتر جهت تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای عفونی است.

این دفتر تحت عنوان مروری بر روشهای ویروس شناسی با بررسی روشهای معمول ویروس شناسی به علاقمندان این رشته و دانشجویان علوم آزمایشگاهی و پزشكی تقدیم می‌گردد.

لازم است قید گردد این كتاب طوری طراحی شده و تنظیم شده كه شخص علاقمند باید با مقدمات اولیه ویروس آشنایی داشته باشد.

 

 

فهرست:

1- كشت سلول

2- كشت ویروس در تخم مرغ جنین دار

3- الیزا “ELISA”

4- ممانعت از هماگلاتیناسیون “HI”

5- واكنش زنجیره های پلیمراز

مقدمه

تعداد زیادی از بیماریهای انسان، حیوان و گیاه با وجود اینكه واگیر و قابل انتقالند توسط باكتریها، قارچها، پروتزوئرها و به طور كلی توسط عواملی ایجاد می شود كه نمی توان آنها را با میكروسكوپ عادی دید، و عفونی بودن اینگونه بیماریها را می‌توان با تزریق مواد آلوده ویا پالیده آنها به دامهای حساس به اثبات رسانید.

ویروسها ازجمله كوچكترین عوامل عفونی می باشند كه به علت دارا بودن خصوصیات مختص خود با سایر موجودات زنده تفاوت دارند. ویروسها را نمی توان درمحیطهای مصنوعی آزمایشگاهی به راحتی تشخیص داد و بمنظور كشت، جداسازی و نهایتاَ شناسائی آنها از حیوانات حساس، تخم مرغ جنین دار و كشت سلول استفاده می شود. در اثر استفاده از تخم مرغ جنین دار برای كشت ویروسها پیشرفت قابل ملاحظه ای درراه شناسایی و جداسازی این عوامل عفونی حاصل شده است.

بیشتر ویروسها به میزبان ویژه ای اختصاص دارند به نحوی كه دربدن میزبان اختصاصی نیز، بافت و یا سلولهای ویژه ای را جهت تكثیر و بقای خود انتخاب می‌كنند. با توجه به دارا بودن چنین شرایط انحصاری دراین دسته ازمیكروارگانیسمهای عفونی می توان بااستفاده از روشهای مخصوص و تكنیكهای مناسب تعداد زیادی از ویروسها را به رشد دربافت میزبان دیگر عادت داد.

نظر به اینكه یاخته ها و پرده های غشائی اطراف جنین مرغ مانند بیشتر بافتهای جنین فعالیتهای اختصاصی دقیقی ندارند رشد و تكثیر تعداد زیادی از ویروسها درآنها امكان پذیر می باشد.

تخم‌های مرغ‌های جنین دار كه درمراحل گوناگون رشد می باشند با بكارگیری روشهای مختلفی می توان درآنها تلقیح نمود بعد از تلقیح تخم مرغها را درشرایط مناسب نگهداری نموده و هر روز بررسی می نمایند. روشهای استانداردی جهت تلقیح ویروسهای مختلف به غشاء كوریوآلانتوئیك، كیسه آمنیوتیك، كیسه آلانتوئیك، كیسه زرده یا جنین، داخل مغز جنین و داخل عضلانی موجود است. مایع یا بافتهای آنها را پس مدت زمان برداشته و تكثیر ویروس یا آسیب‌های ناشی از آن رابررسی می‌كنند.

واكنش بین ویروس ومیزبان خیلی اختصاصی بوده و از نظر بیولوژی ویروسها، بازتاب تنوع سلولهای میزبان آنها می باشد. تنوع دربین ویروسها به روشهای گوناگونی كه ویروسها برای تكثیر و باقی ماندن ازخود نشان می دهند بستگی دارد.

درزمینه كشت ویروسها نیز قدمهای مهم و با ارزشی برداشته شده است تلقیح به تخم مرغ یا استفاده از كشت سلول كه به ترتیب توسط ودروف (Woodruff) و پاركر (Parker) انجام پذیرفت ازمفیدترین روشهاست كه برای رشد ویروسها به كاررفته است و درحال حاضر در آزمایشگاههای ویروس شناسی مورد استفاده می باشد پیشرفتهایی كه درزمینه علوم بیوفیزیك، بیوشیمی، ایمنی شناسی و ژنتیك حاصل شده، به شناخت ماهیت ویروسها كمك قابل توجهی كرده است. استفاده از دستگاههایی نظیر میكروسكوپ الكترونی، اولتراسانتریفوژ، میكروسكوپ فلورسنت و اولترافیلتر درپیشبرد ویروس شناسی بسیار موثربوده است.

روشهای مختلف تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای ویروسی برسه اصل استوار است 

1. جداسازی ویروس
2. روشهای سرمی
3. روشهای ملكولی

 

1-1 جداسازی ویروس

برای كشت و جداكردن ویروسها معمولاً ازحیوانات حساس، تخم مرغ جنین دار ویا كشت سلول استفاده می شود. نمونه های مایع را كه عاری از باكتری باشند می توان مستقیماً و یا پس از رقیق كردن به محیط زنده تلقیح نمود. نمونه های جامد را باید درمحلول تامپون به نسبت 20-10 درصد به صورت تعلیق درآورد. سپس توسط سانتریفوژبا دوركم ذرات معلق راجدا ساخت و مایع را دوباره سانتریفوژ كرده  و سپس اقدام به كشت نمود.

1- ا- الف-كشت درتخم مرغ جنین دار

دراثر استفاده از تخم مرغ جنین دار برای كشت ویروسها پیشرفت قابل ملاحظه ای درراه شناسایی و جداسازی این عوامل بوجود آمده است. نظر به اینكه بافت ها و پرده های غشایی اطراف جنین مرغ مانند بیشتر بافتهای جنین فعالیتهای اختصاصی دقیقی ندارند، رشد تعداد زیادی از ویروسها درآنها امكان پذیر می باشد.

1-1- ب - جداكردن دركشت سلول

پیشرفتهای حاصل دركشت سلول وسیله با ارزشی برای جداسازی و تكثیر ویروسها در اختیار ویروس شناسان قرارداده است. ازدیاد ویروس دركشت سلول را می توان به روشهای مختلف ازقبیل اثر بیماری زائی درسلول(CPE) تداخل ویروسها(Interference)، جذب گلبولهای قرمز به یاخته های حاوی ویروس (Hemadsorption) هماگلوتنیشن(HA)، جستجوی آنتی ژن توسط ایمونوفلورسنت و یا ثبوت مكمل (CFT) تشخیص داد.

1-1-ج - كشت و جداكردن ویروس درحیوانات

انتخاب حیوان حساس برای جداكردن ویروس نكته اصلی دراین روش است كه دراین رابطه فاكتورهای ضروری زیررا می بایست درنظر گرفت.

1-سن حیوان

2-میزبان طبیعی ویروس

3-منشأ حیوان

درحال حاضر ازاین روش به ندرت استفاده می شود و بیشتر دربررسیهای ویروس شناسی كاربرد دارد.

2-1- تشخیص بیماریهای ویروسی توسط آزمایشهای سرمی

عفونتهای ویروسی معمولاً با واكنشهای ایمنی هومورال و سلولی همراه است، بنابراین سنجش هر یك ازآنها وسیله ای برای تشخیص بیماری می باشد.

ازجمله آزمایشات سرمی متداول می توان به موارد زیر اشاره كرد:

1-آزمایشهای خنثی سازی(NT)

2-واكنش ثبوت مكمل (CFT)

3-واكنش جلوگیری از جمع شدن گلبولهای قرمز(HI)

4-واكنش ایمودیفوژن (I D)

5-واكنش ایمونوفلورسنس (FA)

6-آزمایش ELLSA

3-1- شناسایی بیماریهای ویروسی توسط آزمایشات ملكولی

تاریخچه تلقیح به تخم مرغ جنین دار

اولین بار دانشمندی به نام Good Pasture درسال 1913 به این فكر افتاد كه عوامل عفونی را داخل تخم مرغ  جنین دار كشت دهد تلاش برای ابداع این روش تا سال 1930 به طول انجامید. بخش عمده ای از ویروسهای حیوانی وانسانی را می توان به طور مستقیم و یا پس از عادت دادن درقسمتهای مختلف تخم مرغ جنین دارد تكثیر نمود. وسایل كار نسبتاً ساده بوده و مهارت لازم دراین زمینه را می توان درمدت زمانی معقول فراگرفت. امروزه بخش وسیعی از واكسنهای حیوانی و انسانی و بیش از 90 درصد واكسنهای طیور با این روش تهیه می گردد.

2-1- محاسن استفاده ازتخم مرغ جنین دار

1-دردسترس بودن تخم مرغ نطفه دار و روش انكوباسیون آسان آن

2-امكان انجام تزریق دربخشهای مختلف تخم مرغ جنین دار

3-عمل تلقیح ویروس حتی در آزمایشگاههای با امكانات كم در شرایط مناسب قابل اجراست.

4-امكان نفوذ آلودگی ازخارج به داخل تخم مرغ بسیار كم است.

5-میزان تكثیر ویروس درداخل تخم مرغ جنین دار معمولاً زیاد است.

2-2 منبع تهیه تخم مرغ

منبع تهیه تخم مرغ برای كارهای دقیق ویروسی و تولید واكسن، گله های SPF      می‌باشد ولی برای كارهای روتین می توان از گله های مادر پاك با مدیریت خوب استفاده نمود. باید توجه داشت كه تخم مرغ  جنین دار ممكن است حامل عوامل میكروبی و ویروسی مانند سالمونلا، مایكوپلاسما، انسفالومیلیت، لكوز طیور، نیوكاسل، هپاتیت ویروسی و غیره باشد.

بهتر است تخم مرغ نطفه دار را بلافاصله درانكوباتور مخصوص قرارداده تا جنین رشد كرده و درسن مطلوب مورد تزریق قرارگیرد. اما می توان آنرا به مدت 5 الی 6 روز به طور مطلوب در 18-15 درجه و درصورت لزوم 15 الی 20 روز در 12 درجه سانتیگراد توأم با كاهش احتمالی میزان باروری نگهداری نمود. بدیهی است وجود اطلاعاتی درمورد گله تولید كننده ازقبیل برنامه واكسیناسیون، عیار آنتی بادی، بیماری های گله و داروهای مورد استفاده درقبل یا درهنگام تولید برای ویروس شناس بسیار مفید خواهد بود. آگاه بودن از آلودگی ویروسی و عیار آنتی بادی باعث می شود كه تزریق با دقت كافی ودرمحل مناسب صورت پذیرد  به فرض مثال در آلودگی با نیوكاسل نباید تزریق را دركیسه زرده انجام دهیم.

معمولاً تخم مرغ نطفه دار درماشین جوجه كشی كه قبلاً ضدعفونی شده دردرجه حرارت و رطوبت مناسب قرار می گیرد تا رشد كند. ازانكوباتورهای معمولی نیز    می‌توان استفاده نمود. به این ترتیب كه درجه حرارت 5/37 الی 38 و رطوبت 40 الی 70 درصد را تأمین نموده و تخم مرغها را روزی دوبار و ترجیحاً چهار بار با دست بچرخانیم. بعد از 5-3 روز اولین كندلینگ برای بررسی باروری تخم مرغ صورت گیرد دراین مرحله تخم مرغهای بدون جنین و یا دارای جنین مرده حذف شوند.

در 5-3 روزگی فقط آثار عروق خونی مشاهده می شود.

كندلینگ برای بار دوم قبل از تلقیح، بسته به نوع ویروس و راه تزریق درروزهای 8 و 10 و 11و 12 صورت می گیرد. بعد از تزریق محل تلقیح مسدود و تخم مرغها را به طور ثابت در همان درجه حرارت یا كمی پایین تر به مدت 2 الی 9 روز بسته به نوع ویروس قرار می گیرند. باید توجه داشت كه تمام اجزای جنین تخم مرغ عفونی تلقی می‌گردد و به هنگام بازكردن نباید ازدریل یا دیسك كاربوراندوم استفاده كرد زیرا ایجاد ائروسل می‌نماید و بهتر است از پنس وقیچی استفاده نمود و عملیات مربوطه درزیر هود میكروبیولوژی انجام پذیرد.

البته پس از برداشت تخم مرغها آنها را به مدت 6-4 ساعت در 4 درجه سانیگراد قرار می دهیم. این عمل به منظور انقباض عروق و توقف جریان خون و به حداقل رساندن خونریزی درهنگام صورت می پذیرد سپس محتویات تخم مرغ به منظور بررسی حضور ویروس مورد بازرسی قرار می گیرد.

3-2 علائم رشد ویروس

برخی ویروسها تغییرات مورفولوژیكی بوجود می آورند درحالی كه برخی دیگر باعث مرگ جنین و یا تولید هماگلوتینین ها می گردند. باید توجه داشت كه جابجائی خشن و تزریق نامناسب و آلودگی باكتریائی می تواند موجب مرگ سریع جنین شود كه درهمه موارد توأم با بوی گندیدگی نخواهد بود. و درموارد مشكوك باید كشت باكتریائی صورت گیرد.

4-2 ساختمان تخم مرغ  جنین دارد

1-زرده: حاوی مواد غذایی از قبیل 48 درصد آب –5/17 درصد پروئین –5/32 درصد چربی –یك درصد كربوهیدرات – یك درصد املاح

2-كیسه زرده: باترشح آنزیمهائی محتویات زرده را به صورت محلول درآورده و برای جنین قابل استفاده می كند. 

جهت دریافت فایل

روشهای ویروس شناسی تخم مرغ جنین دار، كشت سلول، Elisa، HI، PCR

لطفا آن را خریداری نمایید