مقاله مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی در 50 صفحه ورد قابل ویرایش
فهرست مطالب
عنوان صفحه
بخش اول: دست كاریهای ژنی در ماهیان
مقدمه................................................................................................................
1-1- به كار گیری پروموتر از ژن ماهیان.....................................................
2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باكتری...............................................
3-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میكروپیل با میكروپیپت.....................
4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انكوبه كردن آن در سیستم بافری...........
5-1- انقال ژن از طریق اسپرم با الكتروپورشن در سیستم بافری................
6-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق الكتروپورش.....................................
7-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میكروپیل با میكرواینجكشن..............
8-1- بررسی امكان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد.............................
بخش دوم : دست كاریهای كروموزومی در ماهیان
1-2- دست كاریهای جنسی.............................................................................
1-1-2- دست كاریهای جنسی با تكنیك ژینوژنز............................................
2-1-2- دست كاریهای مجموعه كروزومی به وسیله تكنیك اندروژنز..........
2-2- پلوئیدی...................................................................................................
1-2-2- تریپلوئیدی.........................................................................................
2-2-2- تتراپلوئیدی........................................................................................
بخش سوم: كلونینگ
مقدمه................................................................................................................
1-3- ایجاد كلون به وسیله دوژینوژنز متوالی................................................
2-3- كلون كردن به وسیله تركیبی از اندروژنز و ژینوژنز...........................
3-3- جابجایی هسته........................................................................................
4-3- جابجایی سلولهای سوماتیك جنینی به جنین دیگر.................................
5-3- دورگه گیری..........................................................................................
4- منابع............................................................................................................
بخش اول: دست كاریهای ژنی در ماهیان
مقدمه:
یكی از زمینه های كه امروزه بیوتكنولوژیست ها روی آن تحقیق می كنند ایجاد گونه های ترانسژنیك است. طبق تعریف ترانسژنیك موجودی است كه، دارای DNA نو تركیبی باشد. به طوری كه در ژنوم آن موجود ژن نو تركیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یكی از جنبه های تولید ترانسژنیك و انتقال DNA به زاده های هدف بعدی می باشد. در این زمینه تكنیك میكرواینجكش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همكاران در سال 1980 گزارش شد. در این تكنیك یك لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد كردن DNA نو تركیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به كار گرفتند. در همین سال میكروانجكش مستقیم DNA نو تركیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیك مورد استفاده قرار گرفته است. طوری كه ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی، موش، قورباغه، مگس سركه، خرگوش و خوك كرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همكاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مركزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق كردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده كرند. در همین سال روكونس (Rokkones) تكنیك میكرواینجكشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تكنیك ابتدا به كمك یك وسیله نوك تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA نو تركیب به كمك پی پت ریز تخم شدند به طوری كه به كیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای كامل را مشخص كردند. چوروت (Chourrout) و همكاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به كار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملكولهای DNA میزبان پیشنهاد شده كه این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از جمله با تریپسن كوریون را برداشته و تزریق میكرواینجكشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی كوچك مدوكا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیك مطرح كرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن كریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میكرواینجكشن وارد كرد. به علت كوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میكرواینجكشن مشكل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور روشهایی جهت غلبه بر این مشكل به كار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem) و همكاران ژن هورمون رشد انسان را به كمك وكتور مناسب از طریق میكروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق كردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همكاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیك انجام شد. همچنین تكنیكهای دیگر شامل الكتروپورشن (Electroporation) شلیك ذرات ژن Shatagun بر روی تخمك و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میكر واینجكشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن كم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیك است علاوه بر این از دیگر مشكلات آن این است كه در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میكرسكوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم تزریق می كنند.
در مجموعه تحقیقات انجام شده، میزان باقی ماندگی جنین هایی كه مورد تزریق قرار گرفته اند بین 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و كارآیی میزان بیان ژن بین 3 تا 70 درصد بوده است. باقی ماندگی جنین ها و كارایی بیان ژن وابسته به فاكتورهایی نظیر سیستم بافری، غلظت DNA و روش های مورد استفاده در تزریق می باشد. لذا در مراحل بعدی غلبه بر این مشكلات مورد توجه قرار گرفت به طوری كه ضمن ساده كردن تكنك و كم كردن هزینه ها كارآیی را افزایش می دهند تا در عمل بتوان در تكنولوژی تكثیر و پرورش آبزیان تعداد زیادی از ماهیان ترانسژنیك را ایجاد كرد. بنابراین روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بكارگیری اسپرم به عنوان یك ناقل مسئله جدیدی نیست بلكه در سال 1971 براكت (Brackett) با وارد كردن ژن خارجی به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فریمن (Fareeman) بر روی ماكیان این تحقیق را انجام داده اند و در سال 1989 لویترانو (Lavitrano) این تكنیك را بر روی موش به كار گرفته است. در سال 1992 كهو (Khoo) تكنیك استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد كردن ژنهای جدید به ماهی زبر به كار گرفت. همچنین در سال 1993 ایكسی (Xie) و همكاران جزئیات انتقال ژن از طریق اسپرم به كمك التروپورشن (Electroporation) بر روی ماهیان لوچ (Loach) و كاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سین) Sin و همكاران انتقال ژن به ماهی چنوك (Chinook) را با همین تكنیك شرح دادند. در این نوشتار جزئیات دستكاریهای ژنی در ماهیان با ذكر مثالهایی بررسی شده است.
1-1- به كار گیری پروموتر از ژن ماهیان
گزارشهای اندكی در ارتباط با تحقیقات به كارگیری پروموتر از ماهی در دسترس است. در ماهی قزل آلای رنگین كمان دو فرم مشابه از ژنهای متالوتیونین بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بیان ژن گزارشگر در محیطهای كشت سلولی است. ولی درباره این ویژگی پروموترژن B در سلولهای ماهی اطلاعات كمی وجود دارد. به منظور طراحی و كتورهای مناسب برای ما هی و مطالعه تنظیم بیان ژن در داخل بدن و شرایط آزمایشگاهی پروموترن ژن B متالوتیونین ماهی قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بیان ژن در لاینهای سلولی انسان و ماهی توسط هونگ (Hong) به كار گرفته شد. به همین منظور وكتور بنام PtMTb – CAT كه دارای 6/4 كیلوباز است طراحی گردید. حدود 261 حفت باز وكتور مربوط به پروموترژن B متالتیونین قزل آلای رنگین كمان (tMTb) كیلو باز آن ژن كلرامفنیكل استیل ترانسفراز (CAT) و سیگنال پلی ادنیلاسیون ویروس SV40 و همچنین 7/2 كیلو باز آن قطعه ای مربوط به پلاسمید PUC18 بوده است همچنین طراحی آن بر پایه ساختمان pBL – CAT تكمیل شده بود. به طوری كه طراحی BL پرایمری دارای سكانس اولیگونكلئوتیدی بر اساس ردیف نكلئوتیدهای سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهی قزل آلا بوده و دارای محل ویژه ای جهت برش توسط آنزیم EcoRI بوده است. همچنین در ساختمان پلاسمید ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازی پروموتر tMTb در جلوی ژن CAT در ساختمان CAT pBL- قرار گرفته است. در كنار این چهار وكتور دیگر طراحی گردید، كه شامل pBL-CAT2-1 كه در آن پروموتر تیمیدین كیناز (TK) ویروسی در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT3-2 بر اساس pBL-CAT2 كه در آن پروموتر TK برداشته بود طراحی شد pTK-CAT2E-3 كه در پلاسیمید PBL-CAT2 تعداد 72 جفت باز تكراری از اینهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتدای ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 كه تعداد 850 جفت باز دارای محل ویژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتیونین IIA انسانی (HmtIIA) به ژن CAT در ساختمان
pBL-CAT3 اضافه شده بود این وكتورها به روی 4 لاین سلولی ماهی و یك لاین انسانی به كار گرفته شدند. طوری كه در آن سلولها با میزان 5/3 پیكومولار از DNA پلاسمید آلوده شدند جزئیات نتایج در جدول شماره یك آمده است.
جدول 1- سنجش فعالیت پروموتر در یك لاین سلولی انسان و چهار لاین سلولی ماهی
-8- بررسی امكان وراثت ژن منتقل شده به نسل های بعد
كهو و همكاران در سال 1992 پلاسمید pUSVCAT كه حاوی ژن گزارشگر CAT بود از طریق اسپرم به ماهیان زبراتو منتقل نموند. نتایج حاصله نشان داد كه پلاسمید حاوی ژن در میان زاده های نسل اول و دوم ظاهر شده است. پلاسمید در طی لقاح اسپرم با تخمك قابلیت انتقال به نسل جدید را داشته است. همچنین در بسیاری از حالات پلاسمید معرفی شده در میزبان اغلب به صورت خارج كروموزومی باقی می‌ماند. البته قطعاتی از DNA الگو ممكن است وارد ژنوم شوند و حالت غیر موزائیك در یكی از مجموع 7 والد ترانسژنیك ماهی زبرا دیده شد. ولی شش تای دیگر حالت موزائیك داشته اند.
تصویر 14- نتایج انتقال ژن از طریق اسپرم با سیستم انكوبه كردن در بافر روی ماهی زبرا كه در آن 7 ماهی ترانسژنیك با ماهیان غیر ترانسژنیك لقاح داده شدند. P (والدین) ، F1 (نسل اول) ،F2 (نسل دوم)،دایره مولد ما ده، مربع مولد نر ،مثلث جنسیت ناشناخته رنگ سیاه نشانه ترانسژنیك است.
علاوه بر این دولین (Delin) و همكاران در سال 1995 ژن هورمون رشد ما هی آزاد چنوك با پروموتر ضد انجماد ماهی روغنی اقیانوس (Ocean pout) را به ماهی آزاد كوهو (Coho) منتقل نموند. نشان داده شد كه، ژن منتقل شده در نسل اول روی رشد ماهیان اثر داشته است. در ادامه این تحقیق 5 تا از ماهیان نر ترانسژنیك تولید شد كه حاوی ژن منتقل شده بوند. (OPAFPGHC) و به حد بلوغ رسیدند برای لقاح تخمكاری ماهیان طبیعی مورد استفاده قرار گرفتند زادهای حاصله بعد از مرحله لاروی یعنی در شروع مرحله الوین (Alevins) دو فنوتیپ مشخص را نشان دادند. به طوری كه اكثر بچه ماهیان رنگ طبیعی قهوه ای مشابه ماهی والد داشته اند در حالی كه تعداد دیگری از آنها دارای فنوتیپ رنگ سبز بوند. اگر چه این اختلاف رنگ زود گذر بود و در مرحله بعد یعنی فرای (Fry) رنگ قهوه ای در ماهیان غیر ترانسژنیك كمتر می شد. بررسیها DNA با PCR نشان داد كه، فنوتیپ سبز با حضور ژن OPAFPGHC مرتبط است بنابراین در تحقیق از رنگ سبز به عنوان شاخصی برای تشخیص ورود ژن استفاده شد بررسیها ثابت كرد كه نرهای ترانسژنیك قادر به انتقال ژن وارده از طریق جرم لاین به سلولهای اسپرم می باشند بنابراین پیشنهاد شده كه ممكن است، ورود DNA منتقل شده به كروموزمی میزبان صورت گرفته باشد یا اینكه همانند سازی DNA آن به صورت خارج كوموزمی صورت گرفته و در طی تقسیمات میوزی به سلولهای بعد منتقل شود. فركانس انتقال آن در این آزمایشات كم و در حد زیر 20 درصد بوده است. این فركانس پائین ناشی از این است كه 50 درصد از سلولهای جرم لاین اولیه كه وارد مرحله تقسیم میوزی شده اند ژن منتقل شده را دریافت كرده اند. فركانس های پائین تر از این ممكن است از این مسئله ناشی شده باشد كه تمام سلولهای اسپرم ژن منتقل شده را دریافت نكرده باشد. در حقیقت یك موزائیسم به طور گسترده در ارگانیسم های موجود ترانسرنیك اتفاق می افتد طوری كه در بافتهای سوماتیك مشابه جرم لاینها این موزائیسم مشاهده می شود. در ارتباط با ظهور رنگ سبز در مرحله الوین در ماهیان ترانسژنیك پیشنهاد شده كه ناشی از تشدید رشد و نمو و رنگ زایی (Pigmentation)بوده است. پیش از شروع تغذیه به افزایش رشد طولی و وزنی ماهیان ترانسژنیك با توجه اینكه هیچ منبع انرژی كمكی داده نشده است. منجر به این نتیجه گیری شده است كه، افزایش بیان ژن هورمون رشد ممكن است میزان رشد را تحت تأثیر قرار دهد یا بر كارایی تبدیل انرژی ذخیره در زرده تخم اثر گذارد. اینكه آیا افزایش رشد به طور مسقیم ناشی از عملكرد هورمون رشد است یا به واسطه ای نظیر عمل فاكتور شبه انسولین (Insulin like – growth factor) GF و همكارانش در سال 1992 پیشنهاد كردند كه بیان ژن IGF در طی مرحله لاروی آزاد ما هیان در رشد اولیه نقش دارد. همچنین نشان داده شده كه، تخم های آزاد ماهیان از منشاء مادری دارای هورمون تیروئید است كه در رشد جنین نقش دارد به طوریكه در این ماهیان هورمون تیروئید T3 به طور وضوع سبب افزایش رشد می شود. علاوه بر این مشخص شده است كه هورمون رشد در دوران جنینی با اثر روی فعالیت آنزیم T4 دایو دیناز De- iodinase سبب افزایش تبدیل T4 به T3 و در نتیجه افزایش رشد می‌شود و IGF شبیه مهره داران عالی سبب افزایش رشد كارتیلاژ می شود.