بررسی ابعاد مولکولی و مورفولوژیکی و فیتوشیمیایی
چکیده
بیش از 139 گونه آلیوم در ایران گزارش شده اند که حدود 30 گونه آن بومی خود ایران هستند . در این میان Allium hirtifolium به لحاظ اینکه تاکنون تحقیقاتی از لحاظ مولکولی و یا مورفولوژیکی بر روی آن انجام نشده و تعداد تحقیقاتی که در مورد این گونه خاص در دنیا انجام گردیده, به لحاظ کمی بسیار اندک می باشد, لذا بر آن شدیم تا با جمع آوری این گیاه از نقاط اصلی رویش ان که عمدتا مناطق مرکزی ایران و خصوصاً استان لرستان است, به بررسی ابعاد مولکولی و مورفولوژیکی و فیتوشیمیایی آن بپردازیم. بررسی های ما بر روی این گونه شامل بخش های زیر می باشد:
بخش اول: جمع آوری و نگهداری مواد گیاهی
ابتدا، نمونه های گیاهی از شانزده منطقه مختلف استان لرستان جمع آوری و در مرحله بعد مرکز تحقیقات منابع طبیعی استان لرستان و همچنین پژوهشکده علوم گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی تعیین هویت گردید و سپس غده ها تا انجام آزمایشات بعدی در یخچال و دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
بخش دوم: بررسی مزرعه ای
غده های آلیوم در آذرماه 1384 در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد در سه تکرار، در هر ردیف 4 غده از هر اکوتیپ خاص به طور تصادفی انتخاب و سپس با فاصله 20 سانتی متر روی ردیف و 35 سانتی متر بین ردیف کشت شدند.
پس از رویش از سطح خاک، اطلاعات مورفولوژیکی از قبیل طول برگ، عرض برگ، ارتفاع ساقه گلدهنده، تعداد برگ، وزن متوسط غده ها در بوته، تعداد غده در بوته، مدت زمان کاشت تا سبز شدن و مدت زمان کاشت تا گل دهی، در هر بوته اندازه گیری شدند.
بخش سوم: بررسی مولکولی با تکنیک RAPD
الف) کشت در گلخانه: در فروردین ماه 1385 تعداد دو غده از هر اکوتیپ به طور تصادفی انتخاب و در گلخانه دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد، در گلدان کشت شدند و پس از رویش از سطح خاک و پس از حدود 10 روز برگهای جوان چیده شده و سریعاً در داخل یخ به آزمایشگاه بیوتکنولوژی پژوهشکده بوعلی محل انجام آزمایشات مولکولی، منتقل گردید و در فریزر و در دمای 20- درجه سانتیگراد تا زمان انجام آزمایش نگهداری شد.
ب) استخراج DNA : با روش Doyle and Doyle یا Hot CTAB ، DNA ها استخراج و پس از استخراج با دستگاه UVTECH، مشاهده گردیده و عکس برداری شدند. با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری کیفیت DNA بررسی شد و نسبت جذب 280/260 اکثر DNA ها بین 2-8/1 بودند که نشان از کیفیت خوب DNA استخراج شده از لحاظ عدم آلودگی به پروتئین و یا DNA و پلی ساکاریدها و ... بود.
ج) PCR : با کمک 20 آغازگر ساخت دانشگاه بریتیش کلمبیا که 16 تا از آنها چند شکلی خوبی نشان دادند و براساس روش آدامز (1998),PCR انجام گردید و پس از الکتروفورز ژل اگارز 5/1 درصد و عکسبرداری از ژل ها ، با نرم افزار(NTSYS 2/02) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و براساس الگوریتم UPGMA دندروگرام رسم گردید.
بخش چهارم: بررسی فیتوشیمیایی
از آنجا که اکثر ترکیبات شیمیایی آلیوم ها ترکیبات گوگردی بوده و چیزی حدود 70 % این ترکیبات را هم آلیسین تشکیل می دهد لذا بررسی فیتو شیمیایی بر روی درصد آلیسین در اکوتیپ های مختلف انجام گردید و عصاره موجود در غده های گیاهان به روش بریتیش فارماکوپه, با مقداری تغییرات استخراج و با روش کاهش جذب در طول موج 324 نانومتر و پس از اختلاط با ماده ای به نام4 – مرکاپتو پیریدین میزان آلیسین اندازه گیری شد.
نتایج حاصل از بررسی مورفولوژیک
پس از ترسیم دندروگرام با کمک نرم افزار SAS شش گروه مختلف مورفولوژیک بدست آمد که تنوع موجود در آنها ارتباط زیادی با تنوع جغرافیایی نداشت. تجزیه واریانس و آزمون دانکن، اختلاف معنی داری را در بین بعضی صفات در اکوتیپ ها نشان داد.
نتایج حاصل از بررسی مولکولی RAPD
در مجموع از 20 آغازگر استفاده شده، 16 تا چند شکلی بسیار بالایی را نشان دادند.درصد چند شکلی تمام آنها بالای 90% برآورد گردید و مشخص شد که تمام آنها از کارایی بالایی در تشخیص ژنوتیپ های مختلف برخوردار هستند. بررسی دندروگرام حاصل از ماتریس 0 و 1 ، اکوتیپ ها را در هر 8 گروه مختلف قرار داد. در این بررسی ارتباط زیادی بین گروه بندی مولکولی و جغرافیایی یافت نگردید.
نتایج حاصل از بررسی فیتوشیمیایی
میزان آلیسین در اکوتیپ ها با هم تفاوت داشت و از 61 /0 تا 63/3 میلی گرم آلیسین در هر گرم غده تازه متفاوت بود.میزان آلیسین با بعضی صفات مورفولوژیک از قبیل وزن غده همبستگی مثبت داشت. از مقایسه نتایج بدست آمده چنین استنباط می شود که تنوع ژنتیکی در میان اکوتیپ ها زیاد بوده بطوریکه حتی در اکوتیپ های یک منطقه نیز این مسئله وجود دارد و علت این تنوع زیاد ژنتیکی ممکن است عواملی از قبیل جهش های ژنی و نیز روش های تولید مثل جنسی باشد که البته این مسئله نیاز به بررسی بیشتری دارد.
در این بررسی مهمترین روش تشخیص چند شکلی و اختلافات ژنتیکی میان اکوتیپ ها استفاده از نشانگر RAPD بود. این روش هم روشی ساده و هم دقیق است و قادر به شناسایی اختلافات کوچک ژنتیکی می باشد.
فصل اول
مقدمـه
استفاده از نشا نگرهای ژنتیک قدمتی برابر با تاریخ بشر دارد. انسانهای نخستین، حتی آنهایی که هنوز کشاورزی را فرا نگرفته بودند و برای ادامه زندگی مجبور به جمع آوری بذر و میوه گیاهان بودند، بدون آنکه خود بدانند از نشانگرهای مورفولوژیک برای شناختن و تمایز انواع بذر و میوه و جانوران وحشی استفاده می کردند و برخی را به برخی دیگر ترجیح می دادند، اما به صورت مدون و دانش مدار، شاید مندل، نخستین کسی بود که از نشا نگرهای مورفولوژیک یا نشا نگرهای مبتنی بر فنوتیپ برای مطالعه چگونگی توارث صفات در نخود فرنگی استفاده کرد (9).
تا قبل از مندل، اصلاح گیاهان به عنوان هنر محسوب می شد و گزینش بر اصول علمی استوار نبود و اصلاحگران موفق افرادی بودند که استعداد زیادتری در تشخیص تنوع موجود داشتند. با پیشرفت علم ژنتیک و علوم وابسته، اصلاح گیاهان، با این علوم مرتبط شد و دیگر هنر و مهارت به تنهایی در امر گزینش دخالت نداشت و به نژادگر بنابر اصول علمی و با تعمّد می توانست تنوع و تغییراتی در گیاهان ایجاد نماید و از این راه واریته ها و ارقام جدید با صفات دلخواه به وجود آورد. (15) استفاده از نشا نگرهای ژنتیک، خصوصاً نشانگرهای مولکولی، ابزاری برای شناسایی تنوع و نوع تنوع هستند.(5) تنوع گونه ها در محیط به توانایی تولید و پایداری آن اکوسیستم وابسته است.(9)
روش های مولکولی ابزاری مناسب برای مطالعه اثر تنوع ژنتیکی گیاهی روی پایداری اکوسیستم هاست. این تنوع را ممکن است در چند سطح مورد بررسی قرارداد. تنوع حیاتی یک اکوسیستم معمولا از روی تعداد گونه های موجود در آن مشخص می شود. ضمن اینکه تنوع درون گونه ای نیز ممکن است سهم قابل توجهی در باروری سیستم داشته باشد. روش های مولکولی، امکانات ویژه را برای ارزیابی تنوع حیاتی ارائه می دهند و می توانند روش کلیدی برای ایجاد راهبردهای حفاظتی مناسب باشند.(13)
کاربردهای علمی بیولوژی مولکولی گیاهی و استفاده از نشانگرها به طور خلاصه شامل : (13)
1- تشخیص گیاهان 2- تشخیص عوامل بیماریزا 3- شناسایی گیاهان تجاری، صنعتی، دارویی 4- بررسی فیلوژنتیکی گیاهان 5- مدیریت گیاهان وحشی 6- مدیریت منابع ژنتیکی 7- اصلاح گیاهان از لحاظ کیفی و کمی و مقاومت به بیمارها و نیز عملکرد 8- انتقال ژن و...
ذخایر گیاهی هر کشور، مهمترین منابع و ثروتهای آن کشور به حساب آمده و ممالکی که به ارزش واقعی این ذخایر پی برده اند، آنها را حتی از طلا و نفت و سایر منابع زیر زمینی با ارزش تر می دانند.
گونه های مختلف Allium دارای ارزشهای فراوانی از لحاظ غذایی، دارویی و پزشکی هستند واثرات متعدد دارویی آنها بررسی شده است و از این خواص دارویی از هزاران سال قبل در درمان بیماریهایی مثل دیابت، بیماری های قلبی و التیام سیستم دفاعی و ایمنی بدن، درمان روماتیسم و... استفاده می شده است.(10)
جنس آلیوم متشکل از بیش از 700 گونه است(61) که بیش از 139 گونه آن در ایران گزارش شده است و در حدود 30 گونه آن بومی خود ایران هستند(78) Allim hirtifolium یک گونه قدیمی و بومی ایران است که به عنوان طعم دهنده و چاشنی غذایی استفاده می شده است.(133) در سالهای اخیر استفاده همه جانبه از نشا نگرهای مولکولی در تحقیقات Allium مثل، توالی یابی DNA، بررسی سریع انواع سیتوپلاسمها و تشخیص گیاهان هیرید و استفاده وسیع در تهیه نقشه های ژنتیکی رو به افزایش است .
مشهورترین ترکیبات فیتوشیمیایی جنس Allium، ترکیبات گوگردی بوده که شاخصترین آنها که در غده ها و پیازهای خورد نشده آنها وجود دارد آلیین یا S- آلیل- (+)L- سیستئین سولفوکسید است و به دنبال خورد کردن یا پودر کردن غده ها، تحت اثر آنزیم آلیناز به آلیسین تبدیل می شود(60). هدف ما در این تحقیق بررسی تنوع موجود در اکوتیپهای A.hirtifolium موجود در مناطق زیست این گونه در استان لرستان از دیدگاه مولکولی با تكنیك (RAPD)، مورفولوژیکی وفیتوشیمیایی(آلیسین) می باشد و رابطه این نشا نگرها با هم و توانایی آنها در تعیین میزان تنوع را مورد بررسی قرار خواهیم داد.
فصل دوم
گیاهشناسـی
2-1- گیاهشناسی Allium hirtifolium
Syn: Allium atropurpureum(78)
این گونه، یك گونه وحشی و پایاست. دارای پیاز تخم مرغی به قطر 4-5/2 سانتی متر. با پوشش خارجی خاکستری رنگ و متشکل از رشته ها یا الیاف جدا از هم و در حال تخریب است. ساقه گلدهنده ، بلند و 120-80 سانتی متر طول داشته و برهنه و بدون برگ می باشد، برگها خطی به اندازه 30-20 سانتیمتر، در پایین نادوانی و گود، دارای پرز سفید یا کرکهای نازک و نرم. گل ها صورتی کم رنگ یا صورتی متمایل به بنفش، مجتمع در چترهای پر گل و محدب، دمگل 6بار بلندتر از گل، گلپوش دارای تقسیمات خطی نرم و سست، تاشده، میله پرچمها کوتاهتر از گل پوش، در پایین پهن و عریض.
موسم گل: اردیبهشت ماه (11)
2-2- انتشار جغرافیایی
غرب: سنندج، باختران، همدان، الوند، اراک، اشترانکوه، خرم آباد، بخش مرکزی: اصفهان، بختیاری، فارس: دشت ارژن، کوه بیل، کاکوم.
2-3- کاریولوژی (20)
بر اساس گزارش (2002) Neriman ozhatay تعداد کروموزومهای پایه A.Atropurpureum یا A.hirtifolium، x=8 است و این گونه یک گونه دیپلوئید بوده و لذا 16=x2=n2
Allium hirtifolium
2-4- موارد مصرف A.hirtifolium
2-4-1- مصارف غذایی: (60)
این گونه در ایران تحت عنوان موسیر شناخته می شود و غده های خشک شده و یا تازه آن در مقیاس ها کم تا متوسط برای مصارف محلی و یا صادرات به کشورهای حوزه خلیج فارس بکار می روند. غده های این گونه بطور گسترده ای در ترکیبات غذایی مختلفی از قبیل ماست، ترشی، برنج، گوشت، سس ها و سالادها به عنوان چاشنی و طعم دهنده استفاده می شود.
2-4-2- استفاده در طب سنتی ایران
در طب سنتی ایران، این گونه به عنوان گیاهی شبیه پیاز شناخته شده و استفاده از آن در درمان درد معده، نقرس، ورم مفاصل، ترشح زیاد غدد چربی در روی پوست سر، درمان بیماریهای پوستی و بواسیر توصیه شده است.
از این گیاه همچنین به عنوان داروی تقویت قوای جنسی و همچنین هضم کننده غذا نام برده شده است.(7)
2-5- تحقیقات انجام شده در مورد Allium hirtifolium
تاکنون تحقیقات بسیار اندکی بر روی این گونه انجام شده است و تنها سه مورد تحقیق انجام گرفته كه به طور خلاصه در زیر به انها اشاره می شود:
1- اثرات ضد تریکوموناسی آزمایشگاهی A.hirtifolium (موسیر ایرانی) در مقایسه با مترونیدازول(90) :
تریکوموناس یک انگل تک یاخته تاژک دار است که سبب بیماریهای مسری و ارثی و ایجاد تورم و التهاب در دستگاه تناسلی زنان می گردد و مهمترین و شایعترین تاژکدار بیماری زا در اروپا و امریکای شمالی است.
شیوع این بیماری در جوامع شهری با فعالیت های جنسی پر خطر و همچنین جوامع جهان سوم بیشتر اتفاق می افتد . براساس یک مطالعه آماری سالانه حدود 4/7 میلیون مورد هر ساله در جهان اتفاق می افتد. مهمترین داروی درمان کننده این بیماری در بعضی کشورها مترونیدازول است .در این تحقیق عصاره هیدروالکلی و عصاره دی کلرومتا نیک موسیر ایرانی در مخلوط 50/50(آب – اتانل) تهیه شد. حداقل غلظت مما نعت کنندگی (MIC) عصاره هیدرالکلی و دی کلرومتا نیک و همچنین مترونیدازول به طور جداگانه به ترتیب10و 5و 2mg/ml تعیین گردید. موسیر ایرانی از رشد T.vaginalis در مقدار و زمان اندک، ممانعت به عمل آورده است. اثرات ضد تریکوموناسی این گیاه را می توان به ترکیبات سولفوره الی از قبیل Allicin، ajoene نسبت داد که اثرات ضد میکروبی آنها ثا بت شده است.
2- تاثیر A.hirtifolium بر پاسخ ایمنی سلولی در موش: (59)
به پای موشهای مورد آزمایش سلولهای گلبول قرمز خون گوسفند تزریق شد که این باعث تورم پا در آنها شد، عصاره های هیدروالکلی و پلی فنولیک A.hirtifolium از تورم پا در موشها جلوگیری کرد. یعنی این مواد از پاسخ ایمنی اکتسا بی فوق الذکر جلوگیری کردند.
3- ارتباط بین ساختمان ساپونینهای A.hirtifolium و A.elburzense و خواص ضد اسپامی آنها: (23)
در این تحقیق مشاهده شد که ساپونینهای جدا شده از این دو گونه، دارای خواص ضد اسپاسمی خوبی هستند و در بهبود آشفتگی ها و اسپاسمهای دستگاه گوارش موثرند.
2-6- جنس آلیوم ( .Allium spp) (61)
2 -6- 1 - مشخصات عمومی وطبقه بندی
جایگاه این جنس و جنسهای وابسته و نزدیک آن برای مدت زمان زیادی مورد اختلاف بوده است. در طبقه بندیهای اولیه نهاندانگان (melchior-1964) در خانواده liliaceae قرار می گرفتند. بعدها ، بخاطر ساختمان گلاذین شان غالبا در خانواده Amarilidaceae قرار می گرفتند. اخیراً، داده های مولکولی، خانواده liliaceae را به تعداد زیادی خانواده کوچك که دارای منشا مشترکی هستند، تقسیم کرده است.در بیشتر بررسی های گیاهشناسی و طبقه بندیهای جدید تك لپه ایها, آلیوم و جنسهای نزدیک و مشابه آن در خانواده مجزای Alliaceae قرار می گیرند که خیلی نزدیک با خانواده Amaryllidaceae است. طبقه بندی زیر بوسیله Takhtajane در سال 1997 مورد قبول واقع شده است:
1.class liliopsidae.
2.subclass liliidae
3.superorder liliianea
4.order Amaryllidales
5.Family Alliaceae
6.subFamily Allioidae
7.Tribe Allieae
8.Genus Allium
بهرحال، سایر طبقه بندیها هنوز اعتبار خودشان را دارند و هنوز در بعضی منابع مورد استفاده قرار می گیرند. جنس آلیوم، یک جنس بزرگ از گیاهان چندساله است که غالبا خصوصیات زیر را دارا میباشند: (61)
1- اندامهای ذخیره ای زیر زمینی آنها شامل: غده ها، ریزومها یا ریشه های متورم است.
2- پیازها: معمولا در ریزومها، پیازهای حقیقی (یک یا حداکثر دو تا اندام ضخیم شده) یا پیازهای دروغین (برگهای قاعده ای متورم با مقطع ضخیم بدون دمبرگ)، با چندین پوشش که غشایی، فیبری یا چرمی هستندو دارای ریشه های یکساله یا چند ساله هستند.
3- ریزومها: متراکم شده و یا طویل شده و به ندرت به شکل رونده اند و به اشکال بسیار متنوع شاخه ای.
4-برگها: به صورت قاعده ای هستند، و ساقه گل دهنده را می پوشانند و به شکل ساقه درآمده اند.
5- براکت ها (برگچه های ریزگل): دو یا چندین عدد، و غالبا به صورت گریبان درآمدهاند .
6- گلادین: به طور متراکم و یکجا جمع شده تا چتری یا به شکل سر، از یک یا چندان گل که به صورت تنک و یا متراکم هستند، تشکیل شده است.
7- گل ها: دارای دمگل، منظم، گلپوش تحتانی و تخمدان فوقانی، و سه قسمتی.
8- گلپوش ها: در دو حلقه نسبتا متمایز، آزاد
9- پرچمها: در دو حلقه(پیچ)، گاهی اوقات در قاعده به هم متصلند که حلقه داخلی، باز است.
10- تخمدان: سه خانه، دارای 2یا تعداد بیشتری تخمک خمیده در هر خانه، گاهی اوقات دارای پیوست های متنوع (کلاله مانند و یا شیپورمانند) و به شکل کپسولهای شکوفا که از محل خط میانی برچه شکفته می شود.
11- خامه: منفرد، دارای کلاله فراهم و ظریف وندرتاً سه قسمتی.
12- بذرها: زوایه دار و یا گرد، سیاه رنگ(لایه اپیدرم متشکل از رنگیزه سیاه) طرز قرار گرفتن سلولها بی نهایت متنوع است.
2-6-2- خصوصیات شیمیایی (61)
حاوی ترکیباتی از قبیل قندها، عموما فروکتانتها و فاقد نشاسته، ودارای موادی از قبیل سیستین سولفوکسایدها که سبب بوهای خاص در هر گونه و یا گروه خاص می شوند.
2-6-3- کاریولوژی (61)
تعداد کروموزوم غالب و پایه دراین جنس در دو سطح8=x و 7=x قرار می گیرد و در هر سطحی گونه هایی پلی پلویید وجود دارد. اشکال مختلف کروموزومی و الگوهای باندی متفاوتی در بین گروه های مختلف این جنس وجود دارد. شکل، رنگ، سایز و بافت ریزومها، پیازها، ریشه ها، برگها، ساقه های گلدهنده، برگچه هایی که گلها را احاطه می کنند، گلادین، گلبرگها(عموما سفید، قرمز تا بنفش و ندرتاً آبی تا زرد)، پرچمها و بذور ممکن است بطور قابل ملاحظه ای در بسیاری از حالات متفاوت باشند. همین وضعیت در مورد آناتومی و ساختمان داخلی تمام قسمتهای یادشده گیاه ویا بین اندامهای گیاه وجود دارد. پیازچه های قاعده ای زیرزمینی و همچنین پیازچه های رویشی هوایی در تکثیر رویشی از اهمیت بسزایی برخوردارند. تا جائیکه اطلاع داریم بیشتر آلیومها، دگرگشن هستند. هیپریداسیون بین گونه ای خودبخودی علیرغم تفکری که قبلا وجود داشت، در آنها وجود دارد ولی موانع تلاقی بین گونه ای حتی در گونه های شبیه از لحاظ مورفولوژیکی نیز وجود دارد.